岐阜ウマ娘カサマツトレーニングセンター学園、通称カサマツトレセン学園。ローカルシリーズ開催地のひとつであるカサマツレース場は閑散としており、設備も人員も日本ウマ娘トレーニングセンター学園（トレセン学園）やトゥインクル・シリーズ（通称、中央）とは雲泥の差。競走ウマ娘もやる気もなくただ惰性でレースをしており、カサマツからトゥインクル・シリーズへ向かうウマ娘は皆無だった。 カサマツトレセン学園のトレーナー・北原穣は、いつかカサマツに自分と重ね合わせて心の底から応援できるウマ娘が現れたら、と願っていた。そんなとき北原は、カサマツトレセン学園に入学してきたオグリキャップの走りに魅了されて彼女をスカウトする。チームメイトのベルノライトの加入、ライバルのフジマサマーチとの激戦を経て、オグリキャップは中京盃で優勝するが、それによってオグリキャップにトゥインクル・シリーズ（中央）への移籍の話が持ち上がる。逡巡する北原とオグリキャップだが、『勝てば中央移籍、負ければ東海ダービー』という条件で出走したゴールドジュニアで北原の『走れ』の声で自分を取り戻したオグリキャップは優勝でカサマツから中央への移籍を決める。

中央トレセン学園に転入したオグリキャップは、ベルノライトとともに北原の叔父でトレーナーの六平銀次郎のチームに入り、転入初戦のペガサスステークスで4連勝中のブラッキーエールを、さらに毎日杯でクラシック有力候補と言われるヤエノムテキを一蹴し、カサマツからの転入に疑問を持つ周囲に対して圧倒的な実力を示す。しかしクラシック登録をしていないオグリキャップは東京優駿（日本ダービー）に出走することができない。『オグリをダービーに出せ』『世代最強ウマ娘がダービーに出ないのはおかしい』という声は日に日に高まり、オグリキャップに完敗したヤエノムテキが皐月賞を制したことでその声はさらに強くなる。その声はシンボリルドルフをも動かし、シンボリルドルフはオグリキャップのダービー出走をURAに直訴。しかし実際にオグリキャップが走ったレースは……

ダービー騒動も終わり、宝塚記念を観戦。そこで“最強”の白き稲妻タマモクロスを知る。東海ダービー、日本ダービー共に夢が破れ目標を失ったオグリキャップだが、「日本一のウマ娘になれ」と電話越しのフジマサマーチに元気を貰う。高松宮杯、毎日王冠と重賞連勝を続け、ついに初G1でありタマモクロスとの初勝負天皇賞・秋が始まる。珍しく先行でレースを進めるタマモクロスにオグリキャップが迫り、限界を感じたタマモクロスだったが家族や恩師への誓いを胸にし“領域”(ゾーン)へ入る。

有馬記念が終わった。タマモクロスとの激闘を制したオグリキャップは名実ともにトゥインクル・シリーズを代表するウマ娘となったが、それと引き換えに怪我を負ってしまい、当分レースには出られなくなる。同様にディクタストライカとスーパークリークも怪我のために休養に入っていた。そんな中、大井の最終兵器イナリワンや、故障からの復活を期する名門メジロ家の令嬢メジロアルダンなど、新たなライバルたちが打倒オグリキャップを掲げて牙を研いでいた。そして怪我から復活したオグリキャップは、今までの追う立場から今度は追われる立場として、彼女たちからの挑戦を受けることになる。

オグリキャップ

声 - 高柳知葉
主人公。大食いで言葉少なめなのは変わらず、制服を着ることなく常に薄汚れたジャージを羽織り、髪をポニーテールにしている。トレードマークのひし形の髪飾りは、彼女の母親がかつて現役の競走ウマ娘だったときに着けていたもの。生まれた時は膝が悪くて歩くことができず、毎日母親から膝のマッサージを受けてようやく歩いたり走ったりできるようになった。走ることが大好きで、前述の膝のこともあって常日頃から『私にとっては立って走れること自体が奇跡』と言っている。ただ純粋に走りたいとカサマツトレセン学園に入学するが、フジマサマーチにそれでいいのかと問われ、以降は勝負も意識するようになる。
走ることが好きだがそれ以外のことには軒並み無頓着で、競走ウマ娘やローカルシリーズの知識に乏しいため、壊れかけた靴を履いてレースに出走したり、レースの勝利後にウイニングライブの仕様がわからずにカサマツ音頭を踊り、観客を唖然とさせたこともある。天然さも変わらず、嫌がらせや嫌味を好意と解釈したり、文字通りに受け取って返答したために結果として相手を煽る形となってしまうことも多々ある。実家は貧乏でボロアパートに母と二人暮らしであった。

タマモクロス

レースの後、帰りの電車を乗り間違えてカサマツにやって来た際に、オグリキャップのレースを偶然目撃する。そのときの彼女の圧倒的な強さに衝撃を受け、同じ芦毛ということもあり、強いライバル心を抱く。当年の天皇賞（春）で優勝、重賞を含む6連勝を飾り、天皇賞（秋）でオグリキャップと対決する。レース前、ナーバスになりがちな一面もある。

スーパークリーク

おっとりした性格である点は他メディアと共通しているが、周囲の人間を甘やかしたがる描写はなく、勝利への強い欲求を垣間見せるキャラクターとなっている。クラスでもあまり目立たない存在で、脚部不安を抱えているため皐月賞とダービーの出走を見合わせていたが、トレーナーの奈瀬と二人三脚で治療とトレーニングに励んだ結果、菊花賞でステイヤーとしての才能を開花させ、会心の走りを見せる。

イナリワン

大井から転入してきたウマ娘。江戸っ子気質で粋を好む。自分の活躍で大好きな大井の名をもっと広めたいと考え、中央トレセン学園に転入してくる。中距離から長距離が得意で、最後の直線での爆発力は目を見張るものがあるが、一方で感情の起伏が非常に激しくムラっ気も大きい。オグリキャップとスーパークリーク不在の天皇賞（春）と宝塚記念を制し、毎日王冠でオグリキャップに対して挑戦状を叩きつける。

サクラチヨノオー

初登場時点で4戦3勝。内気なためか、転入初日のオグリキャップを見て緊張している。ゲーム同様、マルゼンスキーに憧れを抱いている。

ヤエノムテキ

オグリキャップの転入初日に握手をかわし、正々堂々戦うことを宣言する。常に敬語の優等生気質で、日々の学園生活もレースも真面目に取り組んでいるが、オグリキャップに勝負を挑む際に直筆の果たし状を書くなど、古風な一面がある。トレーナーは、祖父の親友である「金剛八重垣流」の師範代が受け持っている。

メジロアルダン

名門メジロ家のウマ娘で、メジロラモーヌの妹。高い素質はあるものの足が非常に繊細で、故障が絶えない。日本ダービーで好走後に骨折が判明して長期療養を強いられるが、春に復帰してオープン戦と高松宮杯を連勝し、毎日王冠でオグリキャップと対決する。

シリウスシンボリ

本編開始前にフランス遠征に行っており、帰国後、毎日王冠でオグリキャップと対戦する。

シンボリルドルフ

中京盃でオグリキャップの才能を見初め、北原に自らオグリキャップの中央トレセン学園への移籍を打診する。オグリキャップには自分に匹敵するウマ娘の枠を超えたスターになる素質があることを感じている。他メディアと比較して性格は厳格であり、威厳のあるキャラクターとして描写されている。

バンブーメモリー

声 - 藍原ことみ
トレセン学園の風紀委員。しばらくレースで結果を出せない日々が続いたが、爪の負荷が少ないダートレースに出続けた事で走法の型が完成し才能が開花。安田記念・スワンSと連勝した後、マイルチャンピオンシップでオグリキャップと対戦する。

ベルノライト

声 - 根本京里
オグリキャップと同時期にカサマツトレセン学園に入学し、ジョーにスカウトされてオグリキャップと同じチームになったウマ娘。愛称は「ベルノ」。体格は小柄で栗毛のショートボブに白いメッシュが入り、"B"の形をした髪飾りをつけている。耳飾りは右。最初はオグリキャップの旺盛な食欲と何を考えているのかわからない雰囲気に怖気づくが、徐々に仲良くなる。走力に目を見張るものはないが、実家はウマ娘専門のスポーツ用品店で、靴や蹄鉄に詳しい。オグリキャップの中央トレセン学園への移籍と同時期にサポート研修生の編入試験に合格し、中央トレセン学園の生徒としてオグリキャップのサポートをする。「ウマ娘」作品群に登場する主要なウマ娘の中では珍しく、競争以外の道を選択している。

フジマサマーチ

オグリキャップのカサマツ時代のライバル。薄浅葱色の段違いストレートヘアーに赤い目を持つ。クールで誰も寄せ付けない印象で、勝利に対する強い執念を持つ。幼いころからストイックに走り続けて優秀な成績を修め、特待生としてカサマツトレセン学園に入学した。入学後は柴崎にスカウトされ、東海ダービー制覇を目標に新バ戦に挑むが、自分をあと一歩のところまで追いつめたオグリキャップに驚愕し、以降彼女を最強のライバルと認識する。オグリキャップが中央に去っても彼女を意識し続けており、彼女のライバルであり続けるべくカサマツで励んでいる。髪飾りは左。逃げが得意。

ノルンエース

オグリキャップのルームメイト。制服を着崩し、スマホを操るギャル風のウマ娘。よくチームメイトのルディレモーノ、ミニーザレディとつるんでいる。最初は悪目立ちしているオグリキャップを執拗にいじめ、ルームメイトであるにもかかわらず彼女を物置部屋に追い払ったり、ルディレモーノ、ミニーザレディと共謀してオグリキャップの妨害をする（ただしオグリキャップにはいじめられたり妨害されているという自覚は全くない）が、一緒に走ったレースで彼我の実力差を思い知って改心し、オグリキャップにウイニングライブのダンスを指導するとともに応援するようになる。実家はダンス教室。

ルディレモーノ

声 - 西川舞
ノルンエースの小学生からの悪友。ウマ娘に珍しい月毛のロングヘアー。目つきの悪いヤンキー少女で口が悪い。

ミニーザレディ

ノルンエースの小学生からの悪友。青鹿毛のおかっぱ頭とメンコが特徴。同じく背が小さいベルノライトをチビと罵っているが、自分の方が背が低い。悪知恵が働き、オグリキャップへの妨害プランは彼女が作っている。

ブラッキーエール

荒々しい口調と攻撃的な目つきが特長の不良ウマ娘。初登場時は9戦5勝で4連勝中。転入初日にオグリキャップに対してカサマツのレースを「砂遊び」と揶揄し、オグリキャップを雑魚呼ばわりするが、5連勝を目指して出走したペガサスステークスで中央移籍初戦のオグリキャップに敗れる。粗暴な外見とは裏腹に子供とファンに優しく、話しかけられた際には誠実に対応する。

ディクタストライカ

パーカーのフードを目深にかぶった栗毛の不良ウマ娘。別名「栗毛の弾丸」。後に、オグリキャップに‘‘領域‘‘のヒントを与える存在になるなど、見た目に反し他のウマ娘が迷ったり落ち込んだりするようなケースでさり気ないフォローが出来るウマ娘である。

メイクンツカサ

六平のチームに所属するウマ娘で、前髪をピンで髪止めしている。優等生で先輩後輩分け隔てなくフレンドリーに接する。

クラフトユニヴァ

六平のチームに所属するウマ娘で、顔にそばかすがあり髪で片目が隠れている内気なウマ娘。面倒見はよく飴を持ち歩いている。

ゴッドハンニバル

六平のチームに所属するウマ娘で、耳当てと右耳にピアスをしておりミステリアスな雰囲気を醸す。ただし見た目だけでポンコツであり、切り株に刺さったりジャージをアイスと間違えたりする。

アキツテイオー

短中距離走を得意とし、「マイルの帝王」と呼ばれる強豪ウマ娘。宝塚記念ではタマモクロスと対戦するも敗れる。

ロードロイヤル

逃げを得意とするウマ娘。毎日王冠では、パドックで踊っていたシリウスシンボリに顔をぶつけられて鼻血を出し、発走除外の憂き目に遭う。

ダイナムヒロイン

「舞台上のお嬢様」と呼ばれるウマ娘。毎日王冠のパドックで、シリウスシンボリに蹴られる災難に巻き込まれる。レースではオグリキャップを警戒するも敗れる。

オベイユアマスター

ジャパンカップに出走するために来日したウマ娘のひとりで、アメリカ出身。アメリカでの成績はぱっとせず、ジャパンカップでも伏兵扱いを出ない。本人は自身を道化師（エンターテイナー）と称しており、飄々とした言動で周囲を煙に巻くが、今回のジャパンカップ制覇におのれの全てを懸けており、ジャパンカップの出走ウマ娘をつぶさに調べ上げ、タマモクロスをジャパンカップで倒すべき最強のライバルに定めて徹底的に研究し、レースに臨む。

フェイスノーモア

中央からカサマツへきたウマ娘。全日本ウマ娘カップに出走し、中央転入前のイナリワンを相手に完勝する。

北原 穣（きたはら じょう）

声 - 中村章吾
オグリキャップとベルノライトのトレーナー。愛称はジョー。高身長の壮年に見える男性。カサマツトレセン学園のトレーナーをしているが、これといって輝くウマ娘の原石もおらず、ウマ娘もやる気がなかったため惰性でトレーナーをしていたが、ゲート試験でオグリキャップを目撃し、一緒に東海ダービーを目指せる逸材だと目を輝かせてスカウトする。オグリキャップの中央へのスカウトの話を聞いて逡巡するが、最後は「お前が時代を作れ」と彼女を中央へ送り出し、自らも中央のトレーナー試験を受けることを決める。六平は叔父。過去には叔父に対する引け目から、日がな一日パチンコに明け暮れる荒んだ生活をしていた。

柴崎 宏壱（しばさき こういち）

声 - 柴崎哲志
フジマサマーチのトレーナー。オールバックの好青年。マーチに度々助言するも、なぜか不遜な態度を取るマーチに頭を悩ませている。

六平 銀次郎（むさか ぎんじろう）

北原の叔父で、中央トレセン学園のトレーナー。北原にオグリキャップの中京盃行きをやめるように助言する。北原からは「六平（ろっぺい）おじさん」と呼ばれており、彼をトレーナーの世界に誘った恩人でもある。中央トレセン学園に移籍したオグリキャップとベルノライトを、『北原が中央のトレーナーライセンスを取得するまでの間』という条件で自身のチームに加入させる。

藤井 泉助（ふじい せんすけ）

トゥインクル・シリーズを取材している新聞記者。オグリキャップの中央初戦となったペガサスステークスでの勝ちっぷりを目の当たりにしてオグリキャップに惚れこみ、クラシック登録をしていないオグリキャップを何とか日本ダービーに出走させるべく、自らの記事で世論を煽って署名を集め、シンボリルドルフに助力を要請する。
流暢な外国語を話し、外国のウマ娘ともスムーズに会話ができる。

奈瀬 文乃（なせ ふみの）

スーパークリークが所属するチームの担当トレーナー。かつて担当ウマ娘の成績で六平と激戦を繰り広げていたほどの優秀なトレーナーを父に持つ二世トレーナー。"天才"の呼び名が高く、多くの女性ファンを持つ。
担当ウマ娘の体調面にまで気を配り、ウマ娘第一の指導を行う。目立たないスーパークリークのステイヤーとしての才能を見出してじっくりと鍛え上げ、菊花賞で共に奇跡を叶える。

赤坂 美聡（あかさか みさと）

声 - 明坂聡美
トゥインクル・シリーズの実況を担当している実力派アナウンサー。

中央トレセン学園所属のウマ娘が出走する「トゥインクルシリーズ」を、地方の「ローカルシリーズ」と対比して言う言葉。また、本作の中央トレセン学園では競争ウマ娘育成課程とは別に「サポート研修生」課程が併設されている。

トゥインクルシリーズ同様に全国各地に存在する地方のレース場で開催されるウマ娘の競走。現実世界の地方競馬の競馬場と同じ場所にある15か所のレース場で開催される。

オグリキャップが在籍する学校機関で、全国に15か所あるローカルシリーズに出場するウマ娘を育成するトレーニングセンター学園のひとつ。正式名称は「岐阜ウマ娘カサマツトレーニングセンター学園」。制服のデザイン、設備は中央のトレセン学園と異なるが、全寮制の女子校、人間のトレーナーがいるチーム制、という点は同じ。ローカルシリーズの成績優秀者は、まれに中央トレセン学園へスカウトされることがある。

漫画『シンデレラグレイ』で当競馬場が舞台となり、また当競馬場に縁のあるオグリキャップが主人公であることにちなみ、集英社とCygamesの全面協力により、2022年4月29日開催の第11競走にて「ウマ娘 シンデレラグレイ賞」が施行された。オグリキャップが芦毛だったことから、芦毛馬・白毛馬限定競走として行われた。
当初この競走は、単行本第1巻発売の2021年1月19日に、発売を記念した冠協賛レースとして無観客で開催（新型コロナウイルス緊急事態宣言発令のため）される予定だったが、笠松競馬場を巡る一連の競馬法違反事件に関する新たな報道が開催日の早朝に朝日新聞より報じられた事を受け中止になっている。