弘化元年（1844年）、筆頭老中・土井大炊頭（どい おおいのかみ）邸の門前で、明石藩江戸家老の間宮図書が切腹した。間宮の遺体のそばには、将軍徳川家慶の異母弟である明石藩主・松平斉韶（まつだいら なりつぐ）の暴虐ぶりを訴えた直訴状が残されていた。斉韶は気が向けば女を犯し、刀を振り回して人を殺す異常者であったが、その血筋に加え、家慶は次の年に斉韶を老中に抜擢する意向を示していたことから、幕府としては表立って処罰ができなかった。このため土井は苦慮の末、ひそかに斉韶を排除することを決意し、自身が最も信頼する目付・島田新左衛門に秘密暗殺部隊の結成を命じる。暗殺の決行は幕府が関知しない凶行として処理されることが確実であり、実行部隊になることは襲撃成功の是非を問わず、生還したとしてもただちに刑死することを意味した。

新左衛門は「これが最後のご奉公」と心に期し、斉韶暗殺のため、甥である島田新六郎、徒目付組頭の倉永左平太、島田家食客の平山九十郎、平山の知人の浪人・佐原平蔵など12人を集める。12人は参勤交代の行列を待ち構えて討つ計画を決める。斉韶はその残忍さから参勤交代で明石に帰国する際に尾張国を経由する東海道を通行できないことに決められていたため、信濃国・美濃国を経由する中山道を利用していた。12人はまず江戸郊外の戸田の渡し場で行列を待ち受けるが、明石藩の参勤交代をつかさどる鬼頭半兵衛の計略により、通常より多人数、それも武士ばかりの行列が編成されていたため、身をひそめたまま襲撃を断念する。

12人は美濃国の落合宿を決戦の場所と定め、行列に先回りする。ここは道が狭く、斉韶一行に陣形を組ませずに少数対少数で迎え撃つことが期待できた。地元の郷士・木賀小弥太が協力を申し出て、刺客は13人となる。

一方、斉韶一行は、道中の尾張藩領内・木曽上松宿の入り口で、尾張藩陣屋名で「尾張中納言様御達しにより松平左兵衛督様御通行を禁ず」と書かれた立て札を目のあたりにする。それにも構わず進むと、尾張藩士・牧野靭負（まきの ゆきえ）が立ちふさがる。牧野はかつて斉韶一行に本陣を提供した際、斉韶の気まぐれで息子を斬殺され、その妻も犯された末に自害していたため、恨みを晴らすために新左衛門に協力を申し出ていたのだった。落合宿に罠があるとにらんでいた鬼頭は、そこを避けるためにも伊那谷を経由する脇往還を行くことを進言するが、短気な斉韶はそのまま中山道を進むよう命じる。牧野の行為は刺客側の意向を汲んでのことであったが、彼はのちに責任を一身に負う形で切腹した。

斉韶一行は何度も道を変えた末、落合宿に向かわざるを得なくなる。その間13人は、多勢に無勢の不利をカバーするために、宿場のあらゆる場所にさまざまな仕掛けを設けて要塞化し、街路のところどころをふさいで迷路のようにしていた。11月のある日の早朝、ついに斉韶たちと13人は対峙。壮絶な死闘の末、新左衛門は斉韶を倒し、鬼頭と向かい合う。そこで新左衛門は刀を下げ、鬼頭に斬られるがままにした。新左衛門は「これでよい。わしは殿を斬らねば侍の一分が立たぬ。お主もわしを斬らねば侍の一分が立たぬだろう」とつぶやき、息絶えた。鬼頭も刺客の日置八十吉に倒された。

• 島田新左衛門 - 片岡千恵蔵
• 島田新六郎 - 里見浩太郎
• 鬼頭半兵衛 - 内田良平
• 土井大炊頭利位 - 丹波哲郎
• 芸者おえん - 丘さとみ
• 牧野千世 - 三島ゆり子
• 加代 - 藤純子
• 牧野妥女 - 河原崎長一郎
• 佐原平蔵 - 水島道太郎
• 樋口源内 - 加賀邦男
• 小倉庄次郎 - 沢村精四郎
• 三橋軍次郎 - 阿部九州男
• 木賀小弥太 - 山城新伍
• 浅川十太夫 - 原田甲子郎
• 日置八十吉 - 春日俊二
• 小泉頼母 - 明石潮
• 大竹茂助 - 片岡栄二郎
• 丹羽隼人 - 北竜二
• 老中A - 香川良介
• 松平左兵衛督斉韶 - 菅貫太郎

• 石塚利平 - 和崎俊也
• 三州屋徳兵衛 - 水野浩
• 仙田角馬 - 小田部通麿
• 間宮岸乃（間宮図書の妻） - 松浦築枝
• 斉韶の近習 - 相原昇
• 大野多仲（明石藩士） - 堀正夫
• 間宮図書 - 高松錦之助
• 堀井弥八 - 汐路章
• 出口源四郎 - 有川正治
• 老中B - 藤井貢
• 田中亮三
• 斉韶の近習 - 嵐寛童
• 老中C - 尾上華丈
• 土井大炊頭の近習 - 疋田圀男
• 村居京之輔
• 間宮織部 - 神木真寿雄
• 小鮒裕和
• 春川純
• 間宮小浪 - 高橋漣
• 老中D - 土井淳之祐
• 藤原勝
• 土橋勇
• 春日弘

• 倉永左平太 - 嵐寛寿郎
• 平山九十郎 - 西村晃
• 牧野靭負 - 月形龍之介

• 監督 - 工藤栄一
• 企画 - 玉木潤一郎、天尾完次
• 脚本 - 池上金男
• 撮影 - 鈴木重平
• 照明 - 増田悦章
• 録音 - 小金丸輝貴
• 美術 - 井川徳道
• 音楽 - 伊福部昭
• 編集 - 宮本信太郎
• 助監督 - 田宮武
• 記録 - 勝原繁子
• 装置 - 西川春樹
• 装飾 - 川本宗春
• 美粧 - 佐々木義一
• 結髪 - 西野艶子
• 衣裳 - 三上剛
• 擬斗 - 足立伶二郎
• 進行主任 - 藤井又衛
• 語り手 - 芥川隆行

• 東映京都撮影所の「集団抗争時代劇」路線は1963年7月に封切られた『十七人の忍者』によって生まれ、その年の暮れに公開されたこの『十三人の刺客』によってジャンルとして確立された。この両作品とも、天尾完次の企画によるものである。特色としては、まず史実に基づいたリアリズム・タッチである（本作の場合、「明石藩主暗殺」自体はフィクションではあるものの、その根底には徳川家斉の大御所時代が招いた弊害という史実が据えられている）こと、モノクロ映像によってそのリアリズムを引き立てること、そしてクライマックスに権力闘争の結果としての集団による乱闘劇が用意されることが挙げられる。「集団抗争時代劇」が生まれた背景には、同年の『武士道残酷物語』や、前年公開の松竹作品『切腹』などの「リアリズム時代劇」のヒットがあった。また、テレビの登場によって映画界全体が衰退する中で、スターを大量に抱える撮影所が彼らを有効活用するために『忠臣蔵』のようなオールスターキャストによる集団劇を模索した結果であるという説もある。
• 13人のプロフェッショナルが情けを「余計なもの」としてすべて捨て、いかなる困難があってもひたすら最後まで目的を遂行する様子を描くため、描き方は即物的になり、情緒的なものは極力排除された。
• 美濃落合宿での13人対53人の殺陣シーンは、映画のテーマである「平和な時代に人を斬ったことのない侍が刀を持った時の殺陣」を表現するために、1対1の対決を極力避け、集団戦をメインに据えている。撮影にあたっては、殺陣師が殺陣を綿密に指示するのではなく、「ヨーイドン」の掛け声とともに、刀を持った明石藩側の俳優たちを自由に動かし、そこに刺客側の俳優が現われると一斉に斬りかかるというラフな演出を行うことで、斬り合いの混乱をリアリスティックに再現した。また、この作品では手持ちカメラによる移動撮影が採用され、逃げ惑う侍たちや、大人数を相手に修羅場を駆け回る刺客たちの姿をダイナミックに捉えている。

• 興行は惨敗だったとされる。嵐寛寿郎は「時代劇アカンと、東映が見切りをつけたのはこのあたりでおますな」と語っている。興行成功ならず、嵐は「タマジュン（引用注：玉木潤一郎のこと）残念やったと思います。それから間もなくあの世へ行ってもうた」と玉木を偲んでいる。
• 文春文庫ビジュアル版の『洋・邦名画ベスト150 中・上級篇』（1992年刊）では1位に選ばれている。

• YouTube「東映時代劇YouTube」の企画「映画監督・大友啓史が選ぶ東映時代劇3選」の一環として、2023年2月10日16:00（JST）から同年同月19日23:59（JST）まで無料配信が行われている。冒頭では大友啓史による解説も行われている。

2010年には同名のリメイク映画が公開され、また本作の脚本を元にした同名の小説が刊行されるなど、さまざまなリメイク作品や関連作品が生まれている。